Prof. Luisa Mannina, together with her research group, developed a protocol considered as reference in the olive oil NMR analyses. The protocol provides for the 1H NMR analysis, the measurement of selected signals intensity, due to both minor and major compounds, and the data processing through suitable multivariate statistical analyses. The information regarding the distribution of fatty chains on glycerol, which are important to reveal possible esterification processes, is instead provided by 13C NMR spectroscopy. Based on the collected data, a conspicuous NMR database of olive oils from different geographical areas, varieties and harvesting years was obtained.

The application of the NMR protocol allowed to gather information on:

- olive oils geographical origin. The capability of NMR methodology to distinguish olive oils on the basis of their geographical origin seems unique, whereas the conventional analyses suitable for the determination of quality and genuineness seem to be not appropriate for this type of discrimination. Olive oils from different countries of an Italian regions were investigated and classified according to their geographical origin. Within the European TRACE project, a relevant number of samples (896 olive oils, three harvesting years) representatives of the Mediterranean production were analysed and Ligurian olive oils were chosen as a study case. Using discriminant and modelling analyses (PLS-DA and SIMCA), it was possible not only to discriminate Ligurian from not-Ligurian olive oils but also to define the Ligurian olive oil class which turned out to be characterized by specific sensory and quality markers. These results suggest that NMR- methodology associated with the chemometric analysis can give an important contribution in the actual debated problem of PDO products characterization and confirmation. A very important objective is also the development of tools capable to protect the Italian olive oil from mislabelling.

- olive oils varieties. NMR analysis can also be useful to characterize monovarietal olive oils that according their sensorial and chemical characteristics are consumed as they are or are combined to produce suitable blends. Information regarding the olive oil varieties were obtained achieving both 1H and 13C analysis of the NMR methodologies. For instance, monovarietal olive oils from the same geographical area of Sicily were classified according to their variety using 13C NMR approach, through the discovered different fatty acids composition and distribution on glycerol moiety. On the other hand, olive oils of the same Mediterranean varieties, grown in experimental fields located in different countries (Italy and Argentina), were classified according to the country of origin showing a dominant strong effect of the pedoclimatic condition on the variety of the olive oil. A multi methodological approach including NMR analysis was also applied to study monovarietal olive oils from Algeria, showing the potential of these olive oils to produce blends that may compete with other Mediterranean products.

- possible adulterations. Adulteration of high-cost virgin olive oils with less expensive vegetable oils or low-quality olive oils is one of the most common types of frauds. Adulteration of olive oil with bad quality hazelnut oils is a particular case of fraud. The main analytical challenge come from the fact that the hazelnut and olive oils have a very similar chemical composition. Within the European MEDEO project, an NMR-statistical protocol was developed, according to the ISO format and for operators with basic NMR knowledge, to detect the presence of refined hazelnut oil in refined olive oil. The protocol, tested by peer laboratories using spectrometers operating at different magnetic fields (600, 500 and 400 MHz), allowed additions of refined hazelnut oils in refined olive oils below 10% to be detected.

- harvesting period and method, and agronomic and ecological factors. The quality and uniqueness of extra virgin olive oils are primarily determined by genetic and pedoclimatic factors that can be considered “principal” factors but are also influenced by other “secondary” factors such as agronomic practices (irrigation, fertilization, and harvesting method and period) and technological procedures (processing and storage). The NMR protocol, together with a new integrated statistical methodology, was applied to olive oils harvested in two different periods (“green and “ripe” stages) and harvested using two types of hand-held tools, namely combs and shakers. Some minor compounds responsible for quality, nutritional and sensorial aspects such as hexanal, trans-2-hexenal, sn-1,3-diglycerides, and squalene significantly decreased during ripening whereas unsaturated fatty chains turned out to be present at a higher amount in olive oils when the comb hand-held machines were used.

The effect of irrigation as well as of olive trees altitudes were investigated applying the NMR-statistical protocol to olive oils from olive trees subjected to different irrigation regimes and grown at different altitudes. The major effect of the irrigation procedure was to increase the amount of oleic acid and to decrease the amount of saturated fatty acids, that is an important qualitative and nutritional aspect, whereas the altitude of the olive trees influenced the content of minor compounds as squalene that turned out to be in high amount in olive oils from hill-top cultivations.

Flavored olive oils

Flavored olive oils, labelled as condiments are not subjected to the quality controls required for olive oils, even though they tend to be very expensive. In order to determine the quality of these products, different flavoured oils were analyzed obtaining specific flavoured oils NMR fingerprinting, which are particularly useful for the food industry to check the quality and reproducibility of products.

Blueberries are very popular fruits due to their peculiar sensorial, nutritional and healthy properties. In order to have a comprehensive metabolite identification, untargeted and targeted NMR methodologies were applied. Untargeted NMR analysis of blueberries allowed the identification of water-soluble metabolites in the acqueous extract belonging to different classes such as sugars, amino acids, organic acids, and phenolic compounds, as well as metabolites soluble in organic solvent in the organic extract such as triglycerides, sterols, and fatty acids. On the other hand, targeted NMR analysis allowed the identification, in solid phase extract, of five anthocyanins (malvidin-3-glucoside, malvidin-3-galactoside, delphinidin-3-glucoside, delphinidin-3-galactoside, and petunidin-3-glucoside) and also 3-O--L-rhamnopyranosyl quercetin. The water status of fresh and withered blueberries was monitored by portable NMR and fast-field cycling NMR showing a clear sensitivity to the blueberries withering of some NMR parameters (1H depth profiles, T2 transverse relaxation times and dispersion profiles).

In recent years the kiwifruit became an important horticultural crop both for sensorial and nutritional characteristic. The NMR methodologies allowed to obtain a comprehensive metabolic profile of aqueous kiwifruits extracts (Actinidia deliciosa, Hayward cultivar) in terms of sugars, amino acids, organic acids, and other compounds and to monitor the metabolite profile and the water content of the whole fruit over the season. Specific temporal trends ere observed for aminoacids, sugars, organic acids and other metabolites giving, therefore, useful information for the industries which use kiwifruit nutrients in the food production. The water status of kiwifruit was monitored over the season directly from the intact fruit measuring the spin-spin relaxation time (T2)  by means of a portable unilateral NMR instrument, which allows a fully non invasive analysis. Specific trends were observed as a function of time, giving important useful information on food texture and ripening status.

The same NMR analytical protocol, based on complementary high and low field measurements previously applied on kiwifruits from commonly marked Hayward cultivar, was extended to Zespri Gold and CI.GI cultivars. The CI.GI cultivar is a crossbreed from different species of A. deliciosa, characterized by an earlier ripening than that of Hayward kiwifruits, thus promoting the kiwifruits marketing in a different period. Among other Actinidia species, Zespri Gold kiwifruits from Actinidia chinensis, have assumed a certain commercial relevance being characterized by a yellow flesh, a flavor sweeter than that of Hayward kiwifruit and an early ripening. In this context, the NMR based metabolite profiling of the three cultivars monitored over the season allowed to obtain indications on nutritional properties, on the ripening of the fruit, and on the appropriate harvesting time. The metabolic profiling of the three kiwifruits have shown common features, but also important differences in the metabolite behaviour during the growth and development of fruits, conforming, for instance, Zespri’s earlier maturation compared with the two other varieties.

Among fruit-producing rosaceous crops, peach is the second most important fruit crop in Europe after apple. Unfortunately, the Mediterranean fly (Ceratitis capitata) attacks result in a peach disease, causing economically important losses. In order to limit the chance of attacks one of the most promising approaches is the realization of varieties naturally resistant to insect attacks. In this context, the metabolic profiling of peaches from two varieties, Flaminia (FP) and Percoca Romagnola 7, with a different susceptibility to fly attacks was investigated to have indication regarding the compounds related to the resistance to C. capitata attacks. Flamina variety, used for fresh market and characterized by good sensorial properties, is easily attacked by C. capitata, whereas Percoca Romagnola, with its greater firmness and aroma, is known to be able to resist such attacks. The analysis of 1H metabolite profiling showed that the level of glucose, xylose, myo-inositol, choline, isoleucine and valine was higher in Flaminia peaches compared to Percoca Romagnola 7, whereas the level of fumaric acid, alanine, quinic acid, sucrose, fucose, chlorogenic acid and neochlorogenic acid was higher in Percoca Romagnola 7 peaches. The resistances of the Percoca variety towards the attack of the Ceratitis capitata may be due to the presence of some volatile substances whose precursors, such as alanine, are present in high concentration in this variety.

Honey is a complex mixture that contains nutrients and bioactive compounds responsible for its sensorial and biological properties. Among the different types of honey, Sicilian honey produced entirely by the black honeybees (Apis mellifera L. ssp sicula), unfortunately in risk of extinction, is of particular interest as a local product which deserves to be valued. A combined methodology that includes HPLC-PAD-ESI-MSn and NMR spectroscopy allowed to obtain, for the first time, a comprehensive chemical characterization of sulla and dill honeys and of other three unifloral honeys identifying many compounds, some found for the first time. Some quantitative aspects such as the high amount of kojibiose, turanose, and nigerose, especially in dill honey, suggest that this product may exert prebiotic effects. This in-depth knowledge of honey chemical composition can be an important starting point for the enhancement and preservation of local products.

Another noteworthy honey is Manuka honey derived from the manuka tree (Leptospermum scoparium L.), native to Australia and New Zealand. In order  to study in depth the properties of this honey, a multidisciplinary study providing for the antistaphylococcal activity against methicillin-susceptible and -resistant Staphylococcus aureus and the metabolite profiling before and after in vitro simulated gastric and gastroduodenal digestions was proposed. It is notheworthy that undigested manuka honey showed antibacterial activity against all the tested strains whereas gastric digestion samples showed no activity against S. aureus. Finally, honey samples after the gastroduodenal digestion showed again an antistaphylococcal activity. In this case the metabolite analysis, carried out using an explorative untargeted NMR-based approach and a targeted RP-HPLC-PAD-ESI-MSn analysis, was useful to highlight the chemical modifications occurring during digestion and to explain, at least partially, the results of the antibacterial activity. Methylglyoxal, to which most of the antibacterial activity is ascribed, decreases, whereas leptosin, a marker of manuka honey remains stable. An increase of acetic acid and lactic acid was registered suggesting that the organic acids have an important role in the bacterial growth inhibition after the gastroduodenal digestion.

Tea is one of the most popular beverages in the world. The chemical composition of tea beverage is very complex and not yet completely elucidated since it depends on many factors such as plant growth conditions, manufacturing processes and preparation methods. Several epidemiological studies suggested that tea consumption is inversely associated with the risk of developing some chronic diseases and diabetes. Thus, increasing interest in the health properties of tea resulted in a significant rise in scientific investigation on tea chemical composition. In Selected Paper n. 11, the recent results obtained in the tea beverage characterization using targeted chromatographic and NMR techniques are highlighted reporting significant applications of the different analytical approaches. Among the different applications, an interesting application was reported regarding the study of the antistaphylococcal activity as well as the metabolic profiling and polyphenol content of green tea before and after in vitro simulated gastric, duodenal and gastroduodenal digestions. Metabolite analysis, carried out using an explorative untargeted NMR-based approach and a RP-HPLC–PAD–ESI-MSn method, showed that  gastroduodenal digestion results in degradation of polyphenols explaining the loss of activity of gastroduodenal digested samples and why in vivo green tea has neither protective nor therapeutic effects against intestinal and systemic bacterial infections.

Beer is the world’s most widely consumed alcoholic beverage. Among the large number of beer brands available worldwide, an important role is played by Trappist beers, which are peculiar products brewed under the control of Trappist monks, and known for their extremely high quality. In order to propose a model for the authentication of beer products, within the European TRACE project, an NMR and chemometric analytical approach to classify Rochefort 8 (initially called "Spéciale" for its yellowish-brown color and a peculiar pronounced fruity aroma) and other Trappist beers with respect to non-Trappist beers was developed. Discriminant (PLS-DA) and a modeling (SIMCA) approaches led to a very high classification accuracy in beers classification as evaluated by external validation. Moreover, by inspecting the model parameters, it was possible to identify a certain number of metabolites, which could be considered as tentative markers for the categories of interest. Rochefort beers showed a higher content of propanol, pyruvic acid and isopentanol with respect to non-Rochefort samples. This result is associated with the use of selected old yeast strains (Saccaromices Cerevisiae), which have a specific metabolism characterized by a low activity of the lactate dehydrogenase enzyme.

The proposed approach can be used by beers producers to verify that the product has the same metabolite fingerprint over the time and to monitor the functionality of production cycle. The definition of the metabolic profiling can be also useful when frauds such as the replacement with less valuable products are suspected.

Sea bass (Dicentrarchus labrax) is a very popular ocean-going fish with peculiar sensory and nutritional qualities. Due to the increased demand for this fish, in the last decade the aquaculture production has significantly increased and sea bass became one of the most important commercial fish farmed in the Mediterranean area. Therefore, the intensive sea bass production has raised concerns over the quality of farmed fish in comparison with that of wild ones. The NMR methodology allowed to determine the complete metabolic profiling of sea bass aqueous and organic extracts of farmed and wild seabass: water-soluble metabolites belonging to different classes such as sugars, amino acids, dipeptides and organic acids as well as metabolites soluble in organic solvent such as lipids, sterols and fatty acids were identified. The NMR metabolite profiling analysed by a statistical approach, highlighted that these two types of seabass have not only a different fatty acid composition but also different levels of cholesterol and phosphatidylethanolamine and some water-soluble metabolites such as choline, trimethylamine oxide, glutamine, fumaric and malic acids. The high content of DUFA in farmed samples as well as the low amount of PUFA, DHA and EPA fatty acids can be attributed to the terrestrial not expensive dietary of farmed fish

Genetically modified (GM) foods are foods in which modifications in the DNA sequences have been introduced to give the product new properties and abilities. However, the genetic modification can lead to different effects on the plant and induce changes on its metabolism. It is therefore important to develop methodologies able to detect possible undesirable effects due to genetic modifications. In the case of GM products, an NMR protocol was developed that provides a comparison between the metabolic profiles of GM and non-GM products showing the degree of metabolic impact induced by plant genetic breeding and bioengineering. NMR-based surveys, coupled with multivariate analyses, allow to observe metabolic changes in the transgenic lines monitoring metabolic profiles.

Following this protocol, GM maize and GM lettuce were investigated.

- GM maize samples. The investigated GM variety carries a functional Cry1A(b) gene, which confers to the plant the ability to produce Bt insect toxin. The 1H spectra of transgenic and non transgenic samples extracts, assigned by means of 2D experiments, turned out to be conservative, showing the same signals and therefore the same metabolites. However, a higher concentration of ethanol, citric acid, glycine-betaine, trehalose, as well as of another compound not yet completely identified, was observed in the transgenic extracts than in non transgenic ones 

- genetically modified lettuces. The 1H NMR metabolic profiles of three transgenic lettuce lines (Lactuca sativa L.) that over-express the E. coli asparagine synthetase gene are characterized by a better agronomical performance with respect to control samples when compared with those of the wild type at 24, 56, and 64 days after sowing. Statistical analyses based on hydro-soluble compound profiles significantly and maximally discriminated the wild type from GM-lines at 56 days after sowing, that is considered the optimal harvest time. The results show that GM samples contain the same metabolites as non-GM samples but in different concentrations. Compared to control samples, two GM line plants showed higher amino acid content and protein levels, and a lower nitrate contents, accompanied by a modest sink of organic acids,  sucrose, fructose, and inulins whereas the other GM line, at early stages of development, showed a remarkable inulin accumulation, which represent a trait of industrial interest.

The Research activity has also regarded the NMR study of other foodstuffs such as argan oils, royal jelly, saffron, pears, apples and other products such as maize and sorghum ensiling and fermentation products.

La spettroscopia NMR ad alta risoluzione è riconosciuta come una delle principali metodologie per l'analisi metabolomica degli alimenti. Consente di ottenere, infatti, in un singolo esperimento la caratterizzazione completa dell'intera matrice alimentare, come miscela di componenti senza la loro separazione. La prof.ssa Mannina, insieme al suo gruppo di ricerca, ha sviluppato un protocollo analitico che prevede la determinazione del profilo dei metaboliti presenti negli alimenti mediante spettroscopia NMR ad elevata risoluzione e, a seconda del problema specifico, l'elaborazione dei dati NMR ottenuti attraverso opportuna analisi statistica multivariata. L'identificazione della struttura dei metaboliti presenti è abbastanza facile ed immediata e può essere ottenuta dallo spettro NMR 1D della miscela stessa tramite esperimenti 2D, l’aggiunta alla miscela dei composti standard commercial e il confronto con database di composti standard. Utilizzando la metodologia NMR applicata alla metabolomica, è stato possibile:

- avere una informazione completa sui composti presenti nel campione (queste informazioni possono essere utili anche per le industrie interessate a nutrienti specifici per la formulazione di nuovi prodotti);

- monitorare nel tempo i profili metabolomici degli alimenti (questo aspetto può avere un ruolo importante nella determinazione del momento più adatto per la raccolta dei prodotti);

 - classificare i campioni in base alla provenienza geografica, varietà e tipo di produzione e allevamento;

-  rilevare possibili frodi;

- studiare i processi produttivi;

- studiare l'effetto di specifici trattamenti sul campione;

- confrontare i profili metabolomici di campioni di alimenti geneticamente modificati e di campioni di controllo.

Di seguito sono riportati i risultati più interessanti ottenuti su diverse matrici alimentari.

Oli d'oliva

La Prof.ssa Luisa Mannina, insieme al suo gruppo di ricerca, ha sviluppato un protocollo NMR considerato come riferimento nelle analisi NMR dell'olio di oliva. Il protocollo prevede l'analisi 1H NMR, la misura dell'intensità di segnali selezionati, sia composti maggioritari che minoritari, e l'elaborazione dei dati tramite opportuna analisi statistica multivariata. Le informazioni riguardanti la distribuzione delle catene grasse sul glicerolo, importanti per rivelare possibili processi di esterificazione, sono invece fornite dall’analisi 13C NMR.  Sulla base dei dati raccolti, è stato ottenuto un cospicuo database NMR di oli di oliva provenienti da diverse aree geografiche, varietà e anni di raccolta.

L'applicazione del protocollo NMR ha consentito di raccogliere informazioni su:

- origine geografica degli oli di oliva. La capacità della metodologia NMR di distinguere gli oli di oliva sulla base della loro origine geografica sembra unica, mentre le analisi convenzionali adatte alla determinazione della qualità e della genuinità sembrano non essere adeguate per questo tipo di discriminazione. Gli oli di oliva provenienti da diverse città di una regione dell’Italia sono stati studiati e classificati in base alla loro origine geografica. Nell'ambito del progetto europeo TRACE, è stato analizzato un numero rilevante di campioni (896 oli d'oliva, tre anni di raccolta) rappresentativi della produzione mediterranea e gli oli d'oliva liguri sono stati scelti come caso studio. Utilizzando analisi discriminanti e modellistiche (PLS-DA e SIMCA), è stato possibile non solo discriminare gli oli di oliva liguri da quelli non liguri, ma anche definire la classe dell'olio di oliva ligure che si è rivelata caratterizzata da specifici marcatori sensoriali e di qualità. Questi risultati suggeriscono che la metodologia NMR associata ad analisi chemiometrica può dare un contributo importante nell'attuale dibattito sulla caratterizzazione e validazione dei prodotti DOP. Un obiettivo molto importante è anche lo sviluppo di strumenti in grado di proteggere l'olio d'oliva italiano da possibili frodi.

- varietà di oli d'oliva. L'analisi NMR può essere utile anche per caratterizzare gli oli di oliva monovarietali che in base alle loro caratteristiche chimiche e sensoriali vengono consumati tal quali o vengono combinati per produrre miscele adatte. Le informazioni relative alle varietà di olio d'oliva sono state ottenute utilizzando sia le analisi 1H che le analisi 13C della metodologia NMR. Ad esempio, gli oli d'oliva monovarietali della stessa area geografica della Sicilia sono stati classificati in base alla loro varietà utilizzando l'approccio 13C NMR, attraverso l’evidenziazione della diversa composizione e distribuzione degli acidi grassi sulla porzione di glicerolo. D'altra parte, gli oli di oliva delle medesime varietà mediterranee, coltivati in campi sperimentali situati in diversi paesi (Italia e Argentina), sono stati classificati in base al paese di origine, mostrando un effetto prevalente della condizione pedoclimatica rispetto alla varietà dell’olio d’oliva. È stato applicato anche un approccio multi metodologico, inclusa l'analisi NMR, per studiare gli oli d'oliva monovarietali dell'Algeria, mostrando il potenziale di questi oli d'oliva nel produrre miscele che possono competere con altri prodotti mediterranei.

- possibili adulterazioni. L'adulterazione di oli d'oliva vergini ad alto costo con oli vegetali meno costosi o oli d'oliva di bassa qualità è uno dei tipi più comuni di frode. L'adulterazione dell'olio d'oliva con oli di nocciola di cattiva qualità è un caso particolare di frode. La principale sfida analitica deriva dal fatto che gli oli di nocciola e di oliva hanno una composizione chimica molto simile. All'interno del progetto europeo MEDEO, è stato sviluppato un protocollo NMR associato ad analisi statistica, secondo il formato ISO e per operatori con conoscenze NMR di base, per rilevare la presenza di nocciole raffinate in oli d'oliva raffinati. Il protocollo, testato da differenti laboratori utilizzando spettrometri operanti a diversi campi magnetici (600, 500 e 400 MHz), ha consentito di rilevare aggiunte di oli di nocciola raffinati in oli di oliva raffinati inferiori al 10%.

- periodo e metodo di raccolta, fattori agronomici ed ecologici. La qualità e l'unicità degli oli extravergini di oliva sono determinate principalmente da fattori genetici e pedoclimatici che possono essere considerati fattori "principali" ma sono anche influenzati da altri fattori "secondari" come le pratiche agronomiche (irrigazione, fertilizzazione, metodo e periodo di raccolta) e procedure tecnologiche (lavorazione e conservazione). Il protocollo NMR, insieme a una nuova metodologia statistica integrata, è stato applicato agli oli di oliva raccolti in due periodi diversi (fasi "verde e "maturo") e raccolti utilizzando due tipi di strumenti manuali, ovvero pettini e scuotitori. Alcuni composti minori responsabili degli aspetti qualitativi, nutrizionali e sensoriali come esanale, trans-2-esenale, sn-1,3-digliceridi e squalene sono diminuiti significativamente durante la maturazione mentre le catene grasse insature si sono rivelate presenti in quantità maggiore nell'oliva oli quando venivano usate le macchine portatili a pettine.

L'effetto dell'irrigazione e dell'altitudine degli ulivi è stato studiato applicando il protocollo NMR associato ad analisi statistica agli oli di oliva di olivi sottoposti a diversi regimi di irrigazione e coltivati a diverse altitudini. L'effetto principale della procedura di irrigazione è stato quello di aumentare la quantità di acido oleico e di diminuire la quantità di acidi grassi saturi, che è un aspetto qualitativo e nutritivo importante, mentre l'altitudine degli ulivi ha influenzato il contenuto di composti minori come lo squalene che si è rivelato essere in quantità elevata negli oli d'oliva provenienti da coltivazioni collinari.

Oli di oliva aromatizzati

Gli oli di oliva aromatizzati, etichettati come condimenti, non sono soggetti ai controlli di qualità richiesti per gli oli di oliva, anche se spesso solo molto costosi. Per determinare la qualità di questi prodotti, sono stati analizzati diversi oli aromatizzati ottenendo specifiche "impronte NMR" di oli aromatizzati, particolarmente utili all'industria alimentare per verificare la qualità e la riproducibilità dei prodotti.

Frutta

I frutti sono una miscela complessa contenente molti metaboliti che devono essere analizzati per ottenere un quadro chimico completo. In questo contesto, è stato applicato un protocollo analitico NMR basato su misure complementari di alta e bassa risoluzione per ottenere informazioni riguardanti la composizione chimica dei frutti e lo stato idrico dei frutti. La conoscenza del profilo nutrizionale della frutta può essere estremamente importante per le industrie che estraggono dalla frutta composti specifici per ottenere additivi per altri alimenti.

Lo stato idrico dei frutti è stato monitorato direttamente sul frutto integro mediante uno strumento NMR unilaterale portatile, completamente non invasivo, in grado di fornire interessanti informazioni sulla freschezza del frutto, sulla conservabilità, sulla consistenza del cibo e sullo stato di maturazione. I risultati riportati di seguito nel caso di mirtilli e kiwi suggeriscono che la metodologia NMR ad alta risoluzione può essere proposta per monitorare in modo le proprietà nutrizionali/nutraceutiche di diverse varietà di frutti utili per applicazioni industriali mentre protocolli standard NMR a bassa risoluzione basati su misurazioni rapide dello stato dell'acqua del frutto intatto può essere facilmente trasferito alle applicazioni di controllo qualità. Inoltre, la metodologia rilassometrica NMR ha permesso di studiare lo stress da tiraggio nelle piante.

Mirtilli

I mirtilli sono frutti molto apprezzati per le loro peculiari proprietà sensoriali, nutritive e salutari. Al fine di avere un'identificazione completa dei metaboliti, sono state applicate metodologie NMR non mirate e mirate. L'analisi NMR non mirata dei mirtilli ha consentito l'identificazione di metaboliti idrosolubili nell’estratto acquoso appartenenti a classi diverse come zuccheri, amminoacidi, acidi organici e composti fenolici, nonché metaboliti solubili in solventi organici nell’estratto organico come trigliceridi, steroli e acidi grassi. D'altra parte, l'analisi NMR mirata ha consentito l'identificazione, nell’estratto in fase solida, di cinque antociani (malvidin-3-glucoside, malvidin-3-galattoside, delfinidin-3-glucoside, delfinidin-3-galattoside e petunidin-3- glucoside) e anche 3-O--L-rhamnopyranosyl quercitina. Lo stato dell'acqua dei mirtilli freschi e appassiti è stato monitorato mediante NMR portatile e NMR a ciclo rapido, mostrando una chiara sensibilità all'appassimento dei mirtilli di alcuni parametri NMR (profili di profondità 1H, tempi di rilassamento trasversali T2 e profili di dispersione).

Kiwi

Negli ultimi anni il kiwi è diventato un'importante coltura orticola sia per caratteristiche sensoriali che nutrizionali. Le metodologie NMR hanno permesso di ottenere un profilo metabolico completo degli estratti acquosi di kiwi (Actinidia deliciosa, varietà Hayward) in termini di zuccheri, amminoacidi, acidi organici e altri composti e di monitorare il profilo dei metaboliti e il contenuto di acqua dell'intero frutto durante la stagione. Sono stati osservati andamenti temporali specifici di aminoacidi, zuccheri, acidi organici e altri metaboliti fornendo, quindi, informazioni utili per le industrie che utilizzano i nutrienti del kiwi nella produzione alimentare. Lo stato idrico del kiwi è stato monitorato durante la stagione direttamente dal frutto integro misurando il tempo di rilassamento spin-spin (T2) mediante uno strumento NMR unilaterale portatile, che permette un'analisi completamente non invasiva. Sono state osservate tendenze specifiche in funzione del tempo, fornendo importanti informazioni utili sulla consistenza degli alimenti e sullo stato di maturazione.

Lo stesso protocollo analitico NMR, basato su misurazioni complementari di alta e bassa risoluzione precedentemente applicate su kiwi di varietà Hayward comunemente contrassegnate, è stato esteso alle varietà Zespri Gold e CI.GI. La cultivar CI.GI è un incrocio di diverse specie di A. deliciosa, caratterizzate da una maturazione più anticipata rispetto a quella dei kiwi Hayward, favorendo così la commercializzazione dei kiwi in un periodo diverso. Tra le altre specie di Actinidia, i kiwi Zespri Gold da Actinidia chinensis, hanno assunto una certa rilevanza commerciale essendo caratterizzati da una polpa gialla, un sapore più dolce di quello del kiwi Hayward e una maturazione precoce. In questo contesto, il profilo metabolico NMR delle tre cultivar monitorato nel corso della stagione ha consentito di ottenere indicazioni sulle proprietà nutritive, sulla maturazione del frutto e sull'opportuno periodo di raccolta. Il profilo metabolico dei tre kiwi ha mostrato caratteristiche comuni, ma anche importanti differenze nel comportamento dei metaboliti durante la crescita e lo sviluppo dei frutti, conformandosi, ad esempio, alla precoce maturazione di Zespri rispetto alle altre due varietà

Pesche

Tra le colture rosacee da frutto, la pesca è la seconda coltura frutticola per importanza in Europa dopo la mela. Sfortunatamente, gli attacchi della mosca mediterranea (Ceratitis capitata) provocano una malattia del pesco, causando perdite economicamente importanti. Al fine di limitare la possibilità degli attacchi, uno degli approcci più promettenti è la realizzazione di varietà naturalmente resistenti agli attacchi degli insetti. In questo contesto, è stato studiato il profilo metabolico di due varietà di pesche, Flaminia (FP) e Percoca Romagnola 7, con diversa suscettibilità agli attacchi delle mosche per avere indicazioni sui composti legati alla resistenza agli attacchi di C. capitata. La varietà Flamina, utilizzata per il mercato fresco e caratterizzata da buone proprietà sensoriali, è facilmente attaccabile dalla C. capitata, mentre la Percoca Romagnola, con la sua maggiore compattezza e aroma, è nota per resistere a tali attacchi. L'analisi 1H del profilo metabolomico ha mostrato che il livello di glucosio, xilosio, mioinositolo, colina, isoleucina e valina era più alto nelle pesche Flaminia rispetto alla Percoca Romagnola7, mentre il livello di acido fumarico, alanina, acido chinico, saccarosio, fucosio, clorogenico l'acido e l'acido neoclorogenico erano più alti nelle pesche Percoca Romagnola7. Le resistenze della varietà Percoca all'attacco della Ceratitis capitata possono essere dovute alla presenza di alcune sostanze volatili i cui precursori, come l'alanina, sono presenti in alta concentrazione in questa varietà

Miele

Il miele è una miscela complessa che contiene sostanze nutritive e composti bioattivi responsabili delle sue proprietà sensoriali e biologiche. Tra i diversi tipi di miele, il miele siciliano prodotto interamente dalle api mellifere nere (Apis mellifera L. ssp sicula), purtroppo in via di estinzione, è di particolare interesse come prodotto locale che merita di essere valorizzato. Una metodologia combinata che include HPLC-PAD-ESI-MSn e spettroscopia NMR ha permesso di ottenere, per la prima volta, una caratterizzazione chimica completa dei mieli di sulla e aneto e di altri tre mieli monoflora identificando molti composti, alcuni trovati per la prima volta. Alcuni aspetti quantitativi come l'elevata quantità di kojibiose, turanosio e nigerosio, specialmente nel miele di aneto, suggeriscono che questo prodotto possa esercitare effetti prebiotici. Questa profonda conoscenza della composizione chimica del miele può essere un importante punto di partenza per la valorizzazione e la conservazione dei prodotti locali.

Un altro miele degno di nota è il miele di Manuka derivato dall'albero di manuka (Leptospermum scoparium L.), originario dell'Australia e della Nuova Zelanda. Al fine di approfondire le proprietà di questo miele, è stato proposto uno studio multidisciplinare che prevede l'attività antistafilococcica contro lo Staphylococcus aureus meticillino-sensibile e resistente e il profilo dei metaboliti prima e dopo della digestione gastrica e gastroduodenale simulata in vitro. È degno di nota che il miele di manuka non digerito abbia mostrato attività antibatterica contro tutti i ceppi testati mentre i campioni ottenuti con digestione gastrica non hanno mostrato attività contro S. aureus. Infine, i campioni di miele ottenuti per digestione gastroduodenale hanno mostrato di nuovo un'attività antistafilococcica. In questo caso l'analisi dei metaboliti, condotta utilizzando un approccio NMR esplorativo non mirato e un'analisi RP-HPLC-PAD-ESI-MSn mirata, è stata utile per evidenziare le variazioni della composizione chimica che si verificano durante la digestione e per spiegare, almeno in parte, i risultati dell'attività antibatterica. Il metilgliossale, a cui è attribuita la maggior parte dell'attività antibatterica, diminuisce, mentre la leptosina, un marker del miele di manuka, rimane stabile. È stato registrato un aumento dell'acido acetico e dell'acido lattico suggerendo che gli acidi organici hanno un ruolo importante nell'inibizione della crescita batterica dopo la digestione gastroduodenale.

Tè

Il tè è una delle bevande più apprezzate al mondo. La composizione chimica del tè come bevanda è molto complessa e non ancora completamente chiarita poiché dipende da molti fattori, come le condizioni di crescita delle piante, i processi di produzione e i metodi di preparazione. Diversi studi epidemiologici hanno suggerito che il consumo di tè è inversamente associato al rischio di sviluppare alcune malattie croniche e il diabete. Pertanto, il crescente interesse per le proprietà salutari del tè ha portato a un aumento significativo delle indagini scientifiche sulla composizione chimica del tè. Nel lavoro n. 11, vengono evidenziati i recenti risultati ottenuti nella caratterizzazione di bevande a base di tè utilizzando tecniche cromatografiche mirate e la metodologia NMR riportando utili applicazioni dei diversi approcci analitici. Tra le diverse applicazioni, un'interessante applicazione ha riguardato lo studio dell'attività antistafilococcica nonché del profilo metabolico e del contenuto in polifenoli del tè verde prima e dopo della digestion gastrica, duodenale e gastroduodenale simulate in vitro. L'analisi dei metaboliti, eseguita utilizzando un approccio NMR esplorativo non mirato e un metodo RP-HPLC-PAD-ESI-MSn, ha mostrato che la digestione gastroduodenale provoca la degradazione dei polifenoli, spiegando la perdita di attività dei campioni digeriti gastroduodenali e perché il tè verde in vivo non ha effetti protettivi né terapeutici contro le infezioni batteriche intestinali e sistemiche.

Birra

La birra è la bevanda alcolica più consumata al mondo. Tra i numerosi marchi di birra disponibili in tutto il mondo, un ruolo importante è ricoperto dalle birre trappiste, prodotti peculiari fabbricati sotto il controllo dei monaci trappisti e noti per la loro altissima qualità. Al fine di proporre un modello per l'autenticazione di diversi campioni di birra, nell'ambito del progetto europeo TRACE, un approccio analitico NMR associato ad analisi statistica chemiometrica è stato sviluppato per classificare la birra Rochefort 8 (inizialmente chiamato "Spéciale" per il suo colore bruno-giallastro e un pronunciato e peculiare aroma fruttato) e altre birre trappiste rispetto alle birre non trappiste. Gli approcci discriminanti (PLS-DA) e di modellazione (SIMCA) hanno portato a un'accuratezza di classificazione delle birre molto elevata, valutata mediante convalida esterna. Inoltre, esaminando i parametri del modello, è stato possibile identificare un certo numero di metaboliti, che potrebbero essere considerati come marker sperimentali per le categorie di interesse. Le birre Rochefort hanno mostrato un contenuto più elevato di propanolo, acido piruvico e isopentanolo rispetto ai campioni non Rochefort. Questo risultato è associato all'uso di ceppi selezionati di lieviti antichi (Saccaromices Cerevisiae), che hanno uno specifico metabolismo caratterizzato da una bassa attività dell'enzima lattato deidrogenasi.

L'approccio proposto può essere utilizzato dai produttori di birra per verificare che il prodotto abbia la stessa impronta metabolica nel tempo e per monitorare la funzionalità del ciclo produttivo. La conoscenza del profilo metabolico può essere utile anche quando si sospettano frodi come la sostituzione con prodotti di minor valore.

Spigola

Il branzino (Dicentrarchus labrax) è un pesce oceanico molto diffuso con peculiari qualità sensoriali e nutrizionali. A causa dell'aumento della domanda di questo pesce, nell'ultimo decennio la produzione dell'acquacoltura è notevolmente aumentata e il branzino è diventato uno dei più importanti pesci commerciali allevati nell'area del Mediterraneo. Pertanto, la produzione intensiva di branzini ha sollevato preoccupazioni sulla qualità del pesce d'allevamento rispetto a quello selvatico. La metodologia NMR ha permesso di determinare il profilo metabolico completo degli estratti acquosi ed organici sia dei branzini d'allevamento sia dei selvatici: sono stati identificati metaboliti idrosolubili appartenenti a classi differenti quali zuccheri, amminoacidi, dipeptidi e acidi organici nonché metaboliti solubili in solvente organico come lipidi, steroli e acidi grassi. Il profilo metabolico NMR associato ad un approccio statistico, ha evidenziato che questi due tipi di spigola hanno non solo una diversa composizione di acidi grassi ma anche diversi livelli di colesterolo e fosfatidiletanolamina e di alcuni metaboliti idrosolubili come colina, ossido di trimetilammina, glutammina, fumarico e acidi malici. L'alto contenuto di DUFA nei campioni d'allevamento e la bassa quantità di acidi grassi PUFA, DHA ed EPA possono essere attribuiti alla economica dieta terrestre con pesci d'allevamento

Alimenti geneticamente modificati

Gli alimenti geneticamente modificati (GM) sono alimenti in cui sono state introdotte modifiche nelle sequenze di DNA per conferire al prodotto nuove proprietà e capacità. Tuttavia, la modificazione genetica può portare a diversi effetti sulla pianta e indurre cambiamenti nel suo metabolismo. È quindi importante sviluppare metodologie in grado di rilevare possibili effetti indesiderati dovuti a modificazioni genetiche. Nel caso dei prodotti GM, è stato sviluppato un protocollo NMR che fornisce un confronto tra i profili metabolici dei prodotti GM e non GM che mostra il grado di impatto metabolico indotto dal miglioramento genetico delle piante e dalla bioingegneria. Le indagini NMR, abbinate ad analisi statistica multivariata, consentono di osservare i cambiamenti metabolici nelle linee transgeniche monitorando i profili metabolici.

Seguendo questo protocollo, sono stati studiati campioni di mais GM e lattuga GM.

- Campioni di mais GM. La varietà GM studiata porta un gene funzionale Cry1A (b), che conferisce alla pianta la capacità di produrre la tossina insetticida Bt. Gli spettri 1H di estratti di campioni transgenici e non, assegnati tramite esperimenti 2D, si sono rivelati conservativi, mostrando gli stessi segnali e quindi gli stessi metaboliti. Tuttavia negli estratti transgenici è stata osservata una concentrazione maggiore di etanolo, acido citrico, glicina-betaina, trealosio, nonché di un altro composto non ancora completamente identificato rispetto a quelli non transgenici..

- lattughe geneticamente modificate. I profili metabolici 1H NMR di tre linee di lattuga transgenica (Lactuca sativa L.) che sovraesprimono il gene asparagina sintetasi dell’E. coli sono caratterizzati da una migliore performance agronomica rispetto ai campioni di controllo quando confrontati con quelli wild type a 24, 56 e 64 giorni dopo la semina. Le analisi statistiche basate sui profili dei composti idrosolubili hanno discriminato in modo significativo e massimo il wild type dalle linee GM a 56 giorni dopo la semina, che è considerato il tempo di raccolta ottimale. I risultati mostrano che i campioni GM contengono gli stessi metaboliti dei campioni non GM ma in concentrazioni differenti. Rispetto ai campioni di controllo, due piante della linea GM hanno mostrato un contenuto di aminoacidi e livelli di proteine più elevati e un contenuto di nitrati inferiore, accompagnato da un modesto assorbimento di acidi organici, saccarosio, fruttosio e inuline mentre l'altra linea GM, nelle prime fasi di sviluppo, ha mostrato un notevole accumulo di inulina, che rappresenta un tratto di interesse industriale.

L'attività di ricerca ha riguardato anche lo studio NMR di altri alimenti quali l’olio di argan, zafferano, pappa reale, pere, mele e altri prodotti come mais, insilati di sorgo e prodotti di fermentazione.